MVDr. Silvia Barazorda Romero1, Prof. Alois Čížek, CSc2, MVDr. Ludmila Kohoutová2. Prof. MVDr. Zdeněk Knotek, CSc. DECZM (herpetology) 1,3
1Klinika chorob ptáků, plazů a drobných savců, 2Ústav mikrobiologie a imunologie, Fakulta veterinárního lékařství, Veterinární a farmaceutická univerzita Brno, 3Clinic for Avian, Reptile and Fish Medicine, Vetmeduni Vienna (A)
Cílem studie bylo posoudit spektrum bakterií izolovaných u zdravých plazů i u plazů-pacientů kliniky a prověřit účinnost či rezistenci panelu antibiotik, která se u plazů ve veterinární praxi běžně používají. Od prosince 2011 do srpna 2012 bylo odebráno celkem 55 vzorků na bakteriologické vyšetření od 37 plazů chovaných v zájmovém chovu. Od 16 klinický zdravých jedinců byly provedeny výtěry z kloak a choan. Byly vykultivovány pouze gram-negativní bakterie z čeledi Enterobacteriaceae. Sedmdesát izolátů bakterii (63 gram-negativních a 7 gram-pozitivních) bylo testováno na rezistenci vůči antibiotikům modifikovaným Kirby-Bauerovým diskovým difúzním testem.
Nejčastěji byla zjištěna rezistence na ticarcillin (20/37), meropenem (13/37), cefotaxim (11/37) a ceftriaxon (11/37). Izoláty vykazující rezistenci na nejširší spektrum antibiotik byly identifikovány jako Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa a Acinetobacter spp. U 21 nemocných zvířat byly odebrány výtěry z různých postižených míst a bylo zachyceno 15 druhů gram-negativních bakterií a 1 druh gram-pozitivní bakterie. Významná antibiotická rezistence zde byla zjištěna na amoxicilin klavulanát (3/32), tetracyklin (3/32) a potencované sulfonamidy (3/32). Izoláty, vykazující rezistenci na nejširší spektrum antibiotik, byly identifikovány jako Proteus mirabilis, Morganella morganii a Pseudomonas aeruginosa.
Úvod
Plazi představují tradičně široké spektrum pacientů veterinárních klinik. V mnoha případech jsou jejich zdravotní komplikace spojovány s přítomností infekčních agens, především s různými typy bakterií1, které vyvolávají primární infekce nebo infekce sekundární. Pro správnou interpretaci významu záchytu bakteriálního agens je nezbytné mít k dispozici informace o přirozeném výskytu bakterií v organizmu plazů. V tomto směru jsou však dostupné informace značně omezené2. Je známo, že klinicky zdraví plazi vykazují přítomnost rozmanité bakteriální mikroflóry na různých místech a proto jsou tyto bakterie zahrnovány do pojmu rezidentní mikroflóra. Mezi potenciálně patogenní bakterie u plazů patří Acinetobacter, Klebsiella sp., Citrobacter freundii, Pseudomonas spp., Pasteurella sp., Stenotrophomonas maltophilia, Enterobacter sp., koaguláza-pozitivní Staphylococcus spp, a β-hemolytický Streptococcus spp. 1,3-6. Běžně jsou též u plazů zjišťovány různé sérotypy rodu Salmonella, které se mohou lišit svojí klinickou závažností7-8.
Obecně se předpokládá, že gram-pozitivní bakterie nevyvolávají u plazů žádné významné zdravotní komplikace. Mezi výjimky patří koaguláza-pozitivní Staphylococcus a β-hemolytické streptokoky. Při vyhodnocování nálezů v abscedujících játrech plazů byly častěji izolovány bakterie rodu Corynebacterium1,4. Mezi zcela nejčastější infekční agens izolovaná z dýchacího systému plazů patří jednoznačně Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae a S. maltophilia 1,8-11. V dutině ústní plazů se běžně nalézají Pseudomonas spp., Serratia Aeromonas spp, a Providencia spp,, zatímco Escherichia coli je běžně nalézána v trávicím traktu plazů 5,8,12-15.
V abscedujících útvarech jsou prokazovány aerobní bakterie i anaerobní rody16-18. Přirozenou mikroflórou kůže zdravých plazů jsou gram-pozitivní bakterie1,16,19. U plazů s kožními defekty jsou prokazovány bakterie Aeromonas sp, Pseudomonas spp,, Citrobacter spp,, S. maltophilia a houby Trichophyton spp, (Miller a kol. 2004, Cooper 2006). Cílem naší studie bylo posoudit spektrum bakterií izolovaných u zdravých plazů i u plazů-pacientů kliniky a prověřit účinnost či rezistenci panelu antibiotik, která se u plazů ve veterinární praxi běžně používají.
Materiály a metody
Odběr vzorků
Od prosince 2011 do srpna 2012 bylo odebráno 55 vzorků pro bakteriologické vyšetření od 37 plazů chovaných v zajetí (Tab. 1, 2). Plazi byli rozděleni do dvou základních skupin. Skupinu A tvořilo 16 klinický zdravých dospělých chameleónů jemenských (15 samic, 1 samec). V této skupině byly od každého jedince získány stěry z choan i z kloaky. Před odběrem vzorků obdrželi již dříve tři chameleóni marbofloxacin (minimálně 5 dnů, 10 mg/kg SC) a po terapii byli chováni spolu v jednom teráriu. Samice skupiny A ve věku 2,5 – 3 roky, pocházely ze stejného odchovu v České republice. Byly chovány v prostorných teráriích po třech a neměly kontakt s jinými druhy zvířat. Samec chameleóna jemenského byl získán před 3 měsíci od jiného chovatele ve stáří 4 roky, byl chován v teráriu a také neměl kontakt s jinými druhy zvířat.
Skupinu B tvořilo 21 pacientů Kliniky chorob ptáků, plazů a drobných savců FVL VFU Brno, 4 leguáni zelení, 4 chameleoni jemenští, 3 agamy vousaté, 1 ještěrkovec velký, 1 kajman brýlový, 2 krajty tmavé, 1 užovka červená, 1 želva nádherná, 1 klapavka obecná, 1 vejce od klapavky obecné, 1 želva ostruhatá a 1 karetka novoguinejská (Tab. 3). Vzorky byly odebrány v rámci standardního vyšetřovacího postupu. Místy odběru byly abscesy, kůže, trachea, plíce, choany, pleuroperitoneum, kloaka a vnitřní plocha vaječné skořápky. U jedné agamy a jedné želvy byly vzorky odebrány ze dvou postižených míst. Stěry byly provedeny sterilními vatovými tampony a vloženy do transportního média dle Amiese (Oxoid, Basingstoke, UK) a ihned po odběru podrobeny bakteriologickému vyšetření.
Obr. 1 Nanášení bakteriální suspenze na Mueller-Hintonův agar
Obr. 2 Odečítání zóny inhibice na základě měření jejího průměru
Izolace a identifikace bakterií
Vzorky byly kultivovány křížovým roztěrem na krevní agar s 5 % ovčí citrátové krve (Columbia Agar Base, Oxoid, Basingstoke, Hamshire, UK) a na Mac Conkeyův agar (MCA, Oxoid, Basingstoke, Hamshire, UK). Naočkované agary byly inkubovány při teplotě 20 °C po dobu pěti dnů za aerobních podmínek. Vzorky kloakálních výtěrů byly předmnoženy v pufrované protonové vodě (BPW, Oxoid) při 37 °C přes noc a následně podrobeny selektivní izolaci salmonel v modifikovaném semisolidním Rappaport-Vassiliadisově médiu (Oxoid, Basingstoke, Hamshire, UK) podle instrukcí výrobce. Získané kultury bakterií byly orientačně identifikovány posouzením morfologie kolonií, barvením dle Grama, posouzením tvorby oxidázy a katalázy. Konečná identifikace kultur bakterií byla provedena hmotnostní spektrometrií na zařízení MALDI TOF (Bruker) podle instrukcí výrobce. Získané kultury salmonel byly zaslány k sérotypizaci do Národní referenční laboratoře pro salmonely Státního zdravotního ústavu v Praze (SZÚ, dr. Dědičová).
Testování citlivosti vůči antimikrobiálním látkám
Citlivost 70 izolátů byla testována diskovou difúzní metodou na Mueller-Hintonově agaru (Oxoid) v souladu s pokyny Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI dříve NCCLS 2008). Ve skupině A byly izoláty bakterií pocházející ze stěrů z choan testovány s následujícími antibiotiky (koncentrace uvedená v závorkách představuje koncentraci účinné látky v disku): amikacin (30µg), aztreonam (30µg), cefotaxim (30µg), ceftazidim (30µg), ceftriaxon (30µg), ciprofloxacin (5µg), gentamicin (10µg), imipenem (10µg), kolistin (25µg), levofloxacin (5µg), marbofloxacin (5µg), meropenem (10µg), piperacillin (75µg) a ticarcillin (75µg). U kloakálních stěrů bylo použité amoxicilin klavulanát (30µg), ampicilin (10µg), cefalotin (30µg), ceftazidim (30µg), ciprofloxacin (5µg), chloramfenikol (30µg), gentamycin (10µg), kyselina nalidixová (30µg), streptomycin (10µg), sulfonamidy (300µg), tetracyklin (30µg) a potencované sulfonamidy (25µg).
Ve skupině B byly izoláty bakterií testovány s následujícími antibiotiky (koncentrace uvedená v závorkách představuje koncentraci účinné látky v disku): amoxicilin (30µg), amoxicilin klavulanát (30µg), ampicilin (10µg), cefalexin (30µg), cefalotin (30µg), ceftazidim (30µg), ceftiofur (30µg), chloramfenikol (30µg), enrofloxacin (5µg), erythromycin, (15µg) gentamicin (10µg), kolistin (10µg), linkomycin (2µg), marbofloxacin (5µg), oxacilin (1µg), oxytetracyklin (30µg), penicilin (10 units), streptomycin (10µg), sulfonamidy (300µg), tetracyklin (30µg) a potencované sulfonamidy (25µg).
Průměr inhibičních zón kolem každého disku byl měřen a zaznamenáván. Každý izolát bakterií byl klasifikován jako citlivý (C), rezistentní (R) nebo částečně citlivý (I) podle pokynů od CLSI.
Výsledky
Ve skupině A bylo získáno 39 izolátů bakterií (26 ze stěrů choan a 13 ze stěrů kloaky). Ve skupině B bylo získáno 36 izolátů bakterií (11 z kožních stěrů, 9 z abscesů, 7 z dýchacího systému, po 3 ze stěrů z kloaky a vnitřní skořápky, 2 ze stěru vnitřní tělní dutiny a 1 ze stěru z dutiny ústní). Tři vzorky byly negativní.
Ve skupině A byly vykultivovány pouze gram-negativní bakterie. Nejčastěji byly zachyceny bakterie z čeledi Enterobacteriaceae. Test antimikrobiální citlivosti byl proveden u 37 bakterií. Nejčastěji byla zjištěna rezistence na ticarcillin (20/37), meropenem (13/37), cefotaxim (11/37) a ceftriaxon (11/37). Izoláty vykazující rezistenci na nejširší spektrum antibiotik byly identifikovány jako Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas aeruginosa a Acinetobacter spp. Byly izolovány čtyři různé sérotypy salmonel – nejčastější Ago (7/13) a Blijdorp (3/13).
Ve skupině B bylo zachyceno 15 druhů gram-negativních bakterií a 1 druh gram-pozitivní bakterie. Test antimikrobiální citlivosti byl proveden u 32 bakterií. Významná antibiotická rezistence byla zjištěna na amoxicilin klavulanát (3/32), tetracyklin (3/32) a potencované sulfonamidy (3/32). Izoláty, vykazující rezistenci na nejširší spektrum antibiotik, byly identifikovány jako Proteus mirabilis, Morganella morganii a Pseudomonas aeruginosa.
Diskuze
Omezení, týkající se výběru antimikrobiálních látek pro použití k léčbě zvířat v zájmovém chovu, se především týkají toxicity léků a jejich farmakokinetických a farmakodynamických parametrů20. Mezi antimikrobiální látky často používané u plazů patří i ty, které jsou využívány v humánní medicíně, například peniciliny, cefalosporiny, makrolidy, tetracykliny, chloramfenikol, potencované sulfonamidy, aminoglykosidy a fluorochinolony21. Nejčastějšími indikacemi použití antimikrobiálních preparátů u plazů jsou léčba abscesů, popálenin, traumat krunýře, dermatitid, septikémií, stomatitid a infekcí dýchacích cest22,23. Použití antibiotik ve veterinární praxi má za následek především dva hlavní účinky: terapeutický (likvidující infekční organismus) a eliminační (likvidace i jiných bakterií, které nevyvolávají onemocnění). Důsledkem nadměrného používání antibiotik proto může být narušení přirozené bakteriální mikroflóry24 a případně i navození rezistence.AlphaAlpha
Rezistence mikroorganismů vůči antibiotikům závisí na různých mechanismech (mutace, gen získání). Mikroorganismy rezistentní k působení určitého antibiotika mohou být také rezistentní vůči jiným antibiotikům, která sdílejí obdobný mechanismus účinku. Takové vztahy, známé jako zkřížená rezistence existují především mezi látkami, které jsou úzce spojeny chemicky, ale mohou existovat i mezi nepříbuznými chemickými látkami25.Alpha V humánních nemocnicích rezistence představuje významný problém zejména pro léčbu infekcí způsobených druhy Enterococcus spp,, Staphylococcus spp,, Mycobacterium tuberculosis a gram-negativními tyčinkami26.
U zvířat existuje problém rezistence u běžných patogenů i u zoonotických bakterií27 s rizikem převodu faktorů rezistence ze zvířecích izolátů do lidských patogenů přímým kontaktem (mazlení, fyzické zranění) nebo prostřednictvím domácího prostředí (kontaminované potraviny. Horizontální přenos genů rezistence může nastat v opačném směru bakteriálního přenosu. Například: lidské bakterie přenášené na domácí zvířata mohou získat geny rezistence z komenzální flóry domácích zvířat20. Získaný gen antibiotické rezistence prospívá bakterii tehdy, pokud jsou odpovídající antibiotika přítomna28. Vnímavost mikroorganismů vůči antibiotikům může být do určité míry obnovena dočasným pozastavením používání antibiotik u kterých se rezistence již objevila.
V naší studii bylo prokázáno, že izoláty vykazovaly vysokou frekvenci rezistence k testovaným antimikrobiálním látkám i u těch jedinců, kteří nebyli nikdy antibiotiky léčeni. Ve skupině A byly izolovány i bakterie multirezistentní.
Vysoká rezistence bakterií byla potvrzena zejména k beta-laktamovým antibiotikům, ale rezistence k cefalosporinům a chinolonům byla nízká. I když byli někteří plazi před odběrem vzorků léčeni marbofloxacinem, antibiotická rezistence izolovaných bakterií u nich nebyla prokázána.
Závěr
Používání antibiotik by mělo být omezeno jen na indikované situace, kdy je jejich nasazení nezbytné a riziko navození nežádoucí rezistence minimální. Je potřeba, aby bylo používání antibiotik racionální. Mylné představy, že antibiotika jsou zázračný lék bez nežádoucích důsledků, vedly k jejich nevhodnému používání. Navozená rezistence závažných bakteriálních agens vůči celému komplexu původně účinných antibiotik je vážným varováním pro veterinární i humánní medicínu.
Antibiotická léčba všech plazů, u kterých byly izolovány gram-negativní bakterie, dnes není přijatelná, neboť mnoho plazů má gram-negativní bakterie (komenzální nebo oportunistické) jako součást normální flóry. Správná volba antibiotiky závisí na mnoha faktorech, včetně zdroje izolátu, typu pacienta, klinickém a fyzickém stavu pacienta a zkušenosti veterinárního lékaře1. Je nezbytné aplikovat zvolené antibiotikum v souladu s doporučeným dávkovacím schématem a doporučenou cestou, aby se zabránilo podávání sub-terapeutických dávek, které mohou vést k nedostatečné účinnosti a v některých případech se může zvýšit riziko rezistence. Nedostatečná délka podávání může vést k novému vzplanutí infekce25.
Naše výsledky naznačují, že je vhodné provádět testy citlivosti. Běžně používaná antibiotika v klinické praxi u savců, například β laktamy, mohou být u plazů neúčinná kvůli a zbytečně navozovat vyšší riziko rezistence. Ačkoliv má použiti fluorochinolonů pro exotická zvířata v Evropě relativně krátkou historii (od roku 1990), očekává se, že v příštích letech dojde k nárůstu rezistence vůči nim v důsledku zvyšujícího se trendu používání enrofloxacinu i jiných fluorochinolonů (Guardabassi a kol. 2004).
Role zájmového chovu plazů jako potenciálního zdroje antimikrobiální rezistence vyžaduje další zkoumání a monitorováni. Existuje zde riziko přenosu rezistentních bakterií nebo genů rezistence na člověka (Guardabassi a kol. 2004).
Poděkování
Děkujeme technickému personálu Kliniky chorob ptáků, plazů a drobných savců FVL VFU Brno za odbornou péči o pacienty. Práce byla podpořena z fondu podpory institucionálniho výzkumu FVL VFU Brno pro rok 2012.
Literatura
